第57章 实验3食品中蛋白质的测定（GB 5-2010）(2)
（12）对硝基苯酚指示剂溶液（1 g/l）：称取0.1 g 对硝基苯酚指示剂溶于20 ml95%乙醇中，加水稀释至100 ml。
（13）乙酸溶液（1 mol/l）：量取5.8 ml 乙酸，加水稀释至100 ml。
（14）乙酸钠溶液（1 mol/l）：称取41 g 无水乙酸钠或68 g 乙酸钠，加水溶解后并稀释至500 ml。
（15）乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60 ml乙酸钠溶液与40 ml乙酸溶液混合，该溶液ph=4.8。
（16）显色剂：15 ml甲醛与7.8 ml乙酰丙酮混合，加水稀释至100 ml，剧烈振摇混匀（室温下放置稳定3 d）。
（17）氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0 g/l）：称取105 ℃干燥2 h 的硫酸铵0.4720 g 加水溶解后移于100 ml容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0 mg氮。
（18）氨氮标准使用溶液（0.1 g/l）：用移液管吸取10.00 ml氨氮标准储备液于100ml 容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于0.1 mg氮。
3.2.3仪器和设备
（1）分光光度计。
（2）电热恒温水浴锅：100℃ ± 0.5℃。
（3）10 ml具塞玻璃比色管。
（4）天平：感量为1mg。
3.2.4分析步骤
3.2.4.1试样消解
称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1～0.5 g（精确至0.001 g）、半固体试样0.2～1 g（精确至0.001 g）或液体试样1～5 g（精确至0.001 g），移入干燥的100 ml或250 ml定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g硫酸钾及5 ml硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20 ml水，放冷后移入50 ml或100 ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。
3.2.4.2试样溶液的制备
吸取2.00～5.00 ml试样或试剂空白消化液于50 ml或100 ml容量瓶内，加1～2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。
3.2.4.3标准曲线的绘制
吸取0.00 ml、0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80 ml 和1.00 ml 氨氮标准使用溶液（相当于0.00 μg、5.00 μg、10.0 μg 、20.0 μg、40.0 μg、60.0 μg、80.0 μg 和100.0 μg氮），分别置于10 ml比色管中。加4.0 ml乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。
3.2.4.4试样测定
吸取0.50～2.00 ml（约相当于氮＜100 μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 ml比色管中。以下按3.2.3.3自“加4 ml乙酸钠-乙酸缓酸溶液（ph=4.8）及4 ml显色剂……”起操作。试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。
3.2.5分析结果的表述
试样中蛋白质的含量按式（3-2）进行计算。
x=（c-c0）m×v2v1×v4v3×1000×1000×100×f（3-2）
式中：x——试样中蛋白质的含量，g/100g；
c——试样测定液中氮的含量，μg；
c0——试剂空白测定液中氮的含量，μg；
v1——试样消化液定容体积，ml；
v2——制备试样溶液的消化液体积，ml；
v3——试样溶液总体积，ml；
v4——测定用试样溶液体积，ml；
m——试样质量，g；
f——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1 g/100 g 时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1 g/100 g 时，结果保留两位有效数字。
3.2.6精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
3.3燃烧法
3.3.1原理
试样在900～1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测仪（tcd）进行检测。
3.3.2仪器和设备
(1)氮/蛋白质分析仪。
(2)天平：感量为0.1 mg。
3.3.3分析步骤
按照仪器说明书要求称取0.1～1.0 g充分混匀的试样（精确至0.0001 g），用锡箔包裹后置于样品盘上。试样进入燃烧反应炉（900～1200℃）后，在高纯氧（≥99.99%）中充分燃烧。燃烧炉中的产物（nox）被载气co2 运送至还原炉（800℃）中，经还原生成氮气后检测其含量。
3.3.4分析结果的表述
试样中蛋白质的含量按式（3-3）进行计算。
x=c×f（3-3）
式中：x——试样中蛋白质的含量，g/100 g；
c——试样中氮的含量，g/100 g；
f——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
3.3.5精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
3.3.6说明及注意事项
(1)第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定，第三法适用于蛋白质含量在10 g/100 g 以上的粮食、豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定。
(2)上述所有方法均不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。
(3)第一法当称样量为5.0 g 时，定量检出限为8 mg/ 100 g。
(4)第二法当称样量为5.0 g 时，定量检出限为0.1 mg/100 g。
（13）乙酸溶液（1 mol/l）：量取5.8 ml 乙酸，加水稀释至100 ml。
（14）乙酸钠溶液（1 mol/l）：称取41 g 无水乙酸钠或68 g 乙酸钠，加水溶解后并稀释至500 ml。
（15）乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60 ml乙酸钠溶液与40 ml乙酸溶液混合，该溶液ph=4.8。
（16）显色剂：15 ml甲醛与7.8 ml乙酰丙酮混合，加水稀释至100 ml，剧烈振摇混匀（室温下放置稳定3 d）。
（17）氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0 g/l）：称取105 ℃干燥2 h 的硫酸铵0.4720 g 加水溶解后移于100 ml容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0 mg氮。
（18）氨氮标准使用溶液（0.1 g/l）：用移液管吸取10.00 ml氨氮标准储备液于100ml 容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于0.1 mg氮。
3.2.3仪器和设备
（1）分光光度计。
（2）电热恒温水浴锅：100℃ ± 0.5℃。
（3）10 ml具塞玻璃比色管。
（4）天平：感量为1mg。
3.2.4分析步骤
3.2.4.1试样消解
称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1～0.5 g（精确至0.001 g）、半固体试样0.2～1 g（精确至0.001 g）或液体试样1～5 g（精确至0.001 g），移入干燥的100 ml或250 ml定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g硫酸钾及5 ml硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20 ml水，放冷后移入50 ml或100 ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。
3.2.4.2试样溶液的制备
吸取2.00～5.00 ml试样或试剂空白消化液于50 ml或100 ml容量瓶内，加1～2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。
3.2.4.3标准曲线的绘制
吸取0.00 ml、0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80 ml 和1.00 ml 氨氮标准使用溶液（相当于0.00 μg、5.00 μg、10.0 μg 、20.0 μg、40.0 μg、60.0 μg、80.0 μg 和100.0 μg氮），分别置于10 ml比色管中。加4.0 ml乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。
3.2.4.4试样测定
吸取0.50～2.00 ml（约相当于氮＜100 μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 ml比色管中。以下按3.2.3.3自“加4 ml乙酸钠-乙酸缓酸溶液（ph=4.8）及4 ml显色剂……”起操作。试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。
3.2.5分析结果的表述
试样中蛋白质的含量按式（3-2）进行计算。
x=（c-c0）m×v2v1×v4v3×1000×1000×100×f（3-2）
式中：x——试样中蛋白质的含量，g/100g；
c——试样测定液中氮的含量，μg；
c0——试剂空白测定液中氮的含量，μg；
v1——试样消化液定容体积，ml；
v2——制备试样溶液的消化液体积，ml；
v3——试样溶液总体积，ml；
v4——测定用试样溶液体积，ml；
m——试样质量，g；
f——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1 g/100 g 时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1 g/100 g 时，结果保留两位有效数字。
3.2.6精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
3.3燃烧法
3.3.1原理
试样在900～1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测仪（tcd）进行检测。
3.3.2仪器和设备
(1)氮/蛋白质分析仪。
(2)天平：感量为0.1 mg。
3.3.3分析步骤
按照仪器说明书要求称取0.1～1.0 g充分混匀的试样（精确至0.0001 g），用锡箔包裹后置于样品盘上。试样进入燃烧反应炉（900～1200℃）后，在高纯氧（≥99.99%）中充分燃烧。燃烧炉中的产物（nox）被载气co2 运送至还原炉（800℃）中，经还原生成氮气后检测其含量。
3.3.4分析结果的表述
试样中蛋白质的含量按式（3-3）进行计算。
x=c×f（3-3）
式中：x——试样中蛋白质的含量，g/100 g；
c——试样中氮的含量，g/100 g；
f——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
3.3.5精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
3.3.6说明及注意事项
(1)第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定，第三法适用于蛋白质含量在10 g/100 g 以上的粮食、豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定。
(2)上述所有方法均不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。
(3)第一法当称样量为5.0 g 时，定量检出限为8 mg/ 100 g。
(4)第二法当称样量为5.0 g 时，定量检出限为0.1 mg/100 g。