第30章 维生素的测定(2)
12.2.2水溶性维生素的测定
12.2.2.1维生素b1的测定
维生素b1因其分子中含有硫和胺，又称硫胺素。因其发现还与预防和治疗脚气病有关，故又称为抗脚气病维生素、抗神经炎维生素。它是维生素中最早发现的一种，由1个嘧啶环和1个噻唑环通过亚甲基连接形成。维生素b1为白色结晶，易溶于水，在干燥和酸性溶液中稳定，在碱性环境，尤其在长时间煮烧时维生素b1则迅速分解破坏。还原性物质亚硫酸盐、二氧化硫等能使维生素b1失活，当使用亚硫酸盐作防腐剂或用二氧化硫熏蒸谷仓时，维生素b1被分解破坏。
食物中维生素b1定量分析，可利用游离型维生素b1与多种重氮盐偶合呈各种不同颜色，进行分光光度测定；也有将游离型维生素b1氧化成硫色素，测定其荧光强度；还有利用带荧光检测器的高效液相色谱法测定。分光光度法适用于测定维生素b1含量较高的食物，如大米、大豆、酵母、强化食品等；荧光法和高效液相色谱法适用于微量测定。这里主要介绍荧光法。
样品经热稀酸处理，以提取维生素b1。如果所含维生素b1为游离态，可直接在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素（硫色素），在紫外线照射下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中维生素b1量成正比。结构式如下：
维生素b1硫色素
如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使维生素b1与杂质分离，然后以所得溶液作测定。
样品中维生素b1含量根据下列公式计算：
x＝(u－ub)×ρ×vs－sb×v1v2×1m×1001000
式中：x——样品中维生素b1含量，mg/100g；
u——样品荧光强度；
ub——样品空白荧光强度；
s——标准荧光强度；
sb——标准空白荧光强度；
ρ——维生素b1标准使用液浓度，μg/ml；
v——用于净化的维生素b1标准使用液体积，ml；
v1——样品水解后定容之体积，ml；
v2——样品用于净化的提取液体积，ml；
m——样品的质量，g；
1001000 ——样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。
说明及注意事项如下。
(1)一般食品中维生素b1有游离型的，也有结合型，即与淀粉、蛋白质等结合在一起的，故需用酸和酶水解，使结合型b1成为游离型，再采用此法测定。
(2)硫色素能溶解于正丁醇，在正丁醇中比在水中稳定，故用正丁醇等提取硫色素。萃取时振摇不宜过猛，以免乳化，不易分层。
(3)紫外线破坏硫色素，所以硫色素形成后要迅速测定，并力求避光操作。
(4)用甘油-淀粉润滑剂代替凡士林涂盐基交换管下活塞，因凡士林具有荧光。
(5)谷类物质不需酶分解，样品粉碎后用25％酸性氯化钾直接提取，氧化测定。
12.2.2.2维生素b2的测定
维生素b2又名核黄素，由异咯嗪加核糖醇侧链组成，并有许多同系物。在自然界中主要以磷酸酯的形式存在于黄素单核苷酸（fmn）和黄素腺嘌呤二核苷酸（fad）两种辅酶中。纯净的维生素b2为橘黄色晶体，味苦，微溶于水。在中性和酸性溶液中稳定，但在碱性环境中受热易分解。游离的维生素b2对光敏感，特别是在紫外线照射下可发生不可逆的降解而失去生物活性。食物中的维生素b2一般为与磷酸和蛋白质结合的复合化合物，对光比较稳定。
维生素b2广泛存在于动植物食物中，但由于来源和收获、加工储存方法的不同，不同食物中维生素b2的含量差异较大。乳类、蛋类、各种肉类、动物内脏中维生素b2的含量丰富；绿色蔬菜、豆类中含量中等；粮谷类的维生素b2主要分布在谷皮和胚芽中，碾磨加工会丢失一部分维生素b2，故植物性食物中维生素b2的量一般都不高。
测定维生素b2的方法有荧光分光光度法、高效液相色谱法、微生物法等。其中荧光法操作简单、灵敏度高，是应用最普遍的方法。这里介绍硅镁吸附剂净化荧光法。
维生素b2在440～500 nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与维生素b2的浓度成正比。利用硅镁吸附剂对维生素b2的吸附作用除去样品中的干扰荧光测定的杂质，然后洗脱维生素b2，测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(na2s2o4)，将维生素b2还原为无荧光物质，再测定试液中残余杂质的荧光强度，两者之差即为食品中维生素b2所产生的荧光强度。
维生素b2无色维生素b2
样品中维生素b2含量根据下列公式计算：
x＝(u－ub)×ρ×vs－sb×v1v2×1m×1001000
式中：x——样品中维生素b2含量，mg/100g；
u——样品管荧光值；
ub——样品管空白荧光值；
s——标准管荧光值；
sb——标准管空白荧光值；
ρ——维生素b2标准使用液浓度，μg/ml；
v——于氧化去杂质操作的维生素b2标准使用液体积，ml；
v1——用于氧化去杂质操作的试样提取液体积，ml；
v2——样品水解酶解后定容总体积，ml；
m——样品的质量，g；
1001000 ——样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。
说明及注意事项如下。
(1)本法适用于粮食、蔬菜、调料、饮料等脂肪含量少的样品，脂肪含量过高及含有较多不易除去色素的样品不适用。
(2)维生素b2对光敏感，整个操作应尽可能在暗室中进行。
(3)氧化去杂质，加入高锰酸钾的量不易过多，以避免加入双氧水的量大，产生气泡，影响维生素b2的吸附及洗脱。
(4)维生素b2可被低亚硫酸钠还原成无荧光型；但摇动后很快就被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。
12.2.2.3维生素b6的测定
维生素b6实际上包括吡哆醇（pn）、吡哆醛（pl）、吡哆胺（pm）三种衍生物，三种形式间通过酶可互相转换。最常见的市售维生素b6是盐酸吡哆醇。维生素b6参与100余种酶反应，在氨基酸代谢、糖异生作用、脂肪酸代谢和神经递质合成中起重要作用，还与机体免疫功能有关。吡哆醛、吡哆醇和吡哆胺性质相似，它们易溶于水和乙醇，在酸性溶液中稳定，在碱性溶液中易被分解破坏，对光敏感，所以进行实验时需要避光。三者结构式如下：
维生素b6广泛存在于各种动植物食品中，但一般含量不高。酵母及鸡肉、鱼肉等白色肉类含量最高，小麦、玉米、豆类、葵花子、核桃、水果、蔬菜及蛋黄、肉类、动物肝脏等含量也较多。
测定维生索b6的方法有微生物法、荧光法和高效液相色谱法等。其中，微生物法是经典法，它的优点是：特异性高、精密度好、准确度高、操作简便、样品不需要提纯。其缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。荧光法样品需经提纯，操作复杂。高效液相色谱法是目前最先进简便的方法。gb/t 5009.154-2003采用的是微生物法，故这里只介绍微生物法。
微生物的生长与它们对某些特定的维生素的需求有关，因此在微生物分析法中，将某些微生物在含维生素的样品抽提液中的生长速率，与在含已知量维生素对照溶液中的生长速率进行对比，从而得出样品中该维生素的含量。受试微生物可用细菌、酵母等，生长速率可通过测定浊度、产酸量、质量变化或呼吸作用，其中，浊度分析（或光密度）是最常用的方法。维生素b6的含量在2 ng/ml以内，其浓度对卡尔斯伯酵母菌的生长速率有良好的线性关系，可用微生物定量。
12.2.2.1维生素b1的测定
维生素b1因其分子中含有硫和胺，又称硫胺素。因其发现还与预防和治疗脚气病有关，故又称为抗脚气病维生素、抗神经炎维生素。它是维生素中最早发现的一种，由1个嘧啶环和1个噻唑环通过亚甲基连接形成。维生素b1为白色结晶，易溶于水，在干燥和酸性溶液中稳定，在碱性环境，尤其在长时间煮烧时维生素b1则迅速分解破坏。还原性物质亚硫酸盐、二氧化硫等能使维生素b1失活，当使用亚硫酸盐作防腐剂或用二氧化硫熏蒸谷仓时，维生素b1被分解破坏。
食物中维生素b1定量分析，可利用游离型维生素b1与多种重氮盐偶合呈各种不同颜色，进行分光光度测定；也有将游离型维生素b1氧化成硫色素，测定其荧光强度；还有利用带荧光检测器的高效液相色谱法测定。分光光度法适用于测定维生素b1含量较高的食物，如大米、大豆、酵母、强化食品等；荧光法和高效液相色谱法适用于微量测定。这里主要介绍荧光法。
样品经热稀酸处理，以提取维生素b1。如果所含维生素b1为游离态，可直接在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素（硫色素），在紫外线照射下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中维生素b1量成正比。结构式如下：
维生素b1硫色素
如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使维生素b1与杂质分离，然后以所得溶液作测定。
样品中维生素b1含量根据下列公式计算：
x＝(u－ub)×ρ×vs－sb×v1v2×1m×1001000
式中：x——样品中维生素b1含量，mg/100g；
u——样品荧光强度；
ub——样品空白荧光强度；
s——标准荧光强度；
sb——标准空白荧光强度；
ρ——维生素b1标准使用液浓度，μg/ml；
v——用于净化的维生素b1标准使用液体积，ml；
v1——样品水解后定容之体积，ml；
v2——样品用于净化的提取液体积，ml；
m——样品的质量，g；
1001000 ——样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。
说明及注意事项如下。
(1)一般食品中维生素b1有游离型的，也有结合型，即与淀粉、蛋白质等结合在一起的，故需用酸和酶水解，使结合型b1成为游离型，再采用此法测定。
(2)硫色素能溶解于正丁醇，在正丁醇中比在水中稳定，故用正丁醇等提取硫色素。萃取时振摇不宜过猛，以免乳化，不易分层。
(3)紫外线破坏硫色素，所以硫色素形成后要迅速测定，并力求避光操作。
(4)用甘油-淀粉润滑剂代替凡士林涂盐基交换管下活塞，因凡士林具有荧光。
(5)谷类物质不需酶分解，样品粉碎后用25％酸性氯化钾直接提取，氧化测定。
12.2.2.2维生素b2的测定
维生素b2又名核黄素，由异咯嗪加核糖醇侧链组成，并有许多同系物。在自然界中主要以磷酸酯的形式存在于黄素单核苷酸（fmn）和黄素腺嘌呤二核苷酸（fad）两种辅酶中。纯净的维生素b2为橘黄色晶体，味苦，微溶于水。在中性和酸性溶液中稳定，但在碱性环境中受热易分解。游离的维生素b2对光敏感，特别是在紫外线照射下可发生不可逆的降解而失去生物活性。食物中的维生素b2一般为与磷酸和蛋白质结合的复合化合物，对光比较稳定。
维生素b2广泛存在于动植物食物中，但由于来源和收获、加工储存方法的不同，不同食物中维生素b2的含量差异较大。乳类、蛋类、各种肉类、动物内脏中维生素b2的含量丰富；绿色蔬菜、豆类中含量中等；粮谷类的维生素b2主要分布在谷皮和胚芽中，碾磨加工会丢失一部分维生素b2，故植物性食物中维生素b2的量一般都不高。
测定维生素b2的方法有荧光分光光度法、高效液相色谱法、微生物法等。其中荧光法操作简单、灵敏度高，是应用最普遍的方法。这里介绍硅镁吸附剂净化荧光法。
维生素b2在440～500 nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与维生素b2的浓度成正比。利用硅镁吸附剂对维生素b2的吸附作用除去样品中的干扰荧光测定的杂质，然后洗脱维生素b2，测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(na2s2o4)，将维生素b2还原为无荧光物质，再测定试液中残余杂质的荧光强度，两者之差即为食品中维生素b2所产生的荧光强度。
维生素b2无色维生素b2
样品中维生素b2含量根据下列公式计算：
x＝(u－ub)×ρ×vs－sb×v1v2×1m×1001000
式中：x——样品中维生素b2含量，mg/100g；
u——样品管荧光值；
ub——样品管空白荧光值；
s——标准管荧光值；
sb——标准管空白荧光值；
ρ——维生素b2标准使用液浓度，μg/ml；
v——于氧化去杂质操作的维生素b2标准使用液体积，ml；
v1——用于氧化去杂质操作的试样提取液体积，ml；
v2——样品水解酶解后定容总体积，ml；
m——样品的质量，g；
1001000 ——样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。
说明及注意事项如下。
(1)本法适用于粮食、蔬菜、调料、饮料等脂肪含量少的样品，脂肪含量过高及含有较多不易除去色素的样品不适用。
(2)维生素b2对光敏感，整个操作应尽可能在暗室中进行。
(3)氧化去杂质，加入高锰酸钾的量不易过多，以避免加入双氧水的量大，产生气泡，影响维生素b2的吸附及洗脱。
(4)维生素b2可被低亚硫酸钠还原成无荧光型；但摇动后很快就被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。
12.2.2.3维生素b6的测定
维生素b6实际上包括吡哆醇（pn）、吡哆醛（pl）、吡哆胺（pm）三种衍生物，三种形式间通过酶可互相转换。最常见的市售维生素b6是盐酸吡哆醇。维生素b6参与100余种酶反应，在氨基酸代谢、糖异生作用、脂肪酸代谢和神经递质合成中起重要作用，还与机体免疫功能有关。吡哆醛、吡哆醇和吡哆胺性质相似，它们易溶于水和乙醇，在酸性溶液中稳定，在碱性溶液中易被分解破坏，对光敏感，所以进行实验时需要避光。三者结构式如下：
维生素b6广泛存在于各种动植物食品中，但一般含量不高。酵母及鸡肉、鱼肉等白色肉类含量最高，小麦、玉米、豆类、葵花子、核桃、水果、蔬菜及蛋黄、肉类、动物肝脏等含量也较多。
测定维生索b6的方法有微生物法、荧光法和高效液相色谱法等。其中，微生物法是经典法，它的优点是：特异性高、精密度好、准确度高、操作简便、样品不需要提纯。其缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。荧光法样品需经提纯，操作复杂。高效液相色谱法是目前最先进简便的方法。gb/t 5009.154-2003采用的是微生物法，故这里只介绍微生物法。
微生物的生长与它们对某些特定的维生素的需求有关，因此在微生物分析法中，将某些微生物在含维生素的样品抽提液中的生长速率，与在含已知量维生素对照溶液中的生长速率进行对比，从而得出样品中该维生素的含量。受试微生物可用细菌、酵母等，生长速率可通过测定浊度、产酸量、质量变化或呼吸作用，其中，浊度分析（或光密度）是最常用的方法。维生素b6的含量在2 ng/ml以内，其浓度对卡尔斯伯酵母菌的生长速率有良好的线性关系，可用微生物定量。